核酸作为生物体内的一种重要生物大分子，是遗传物质的重要存在形式。其包括DNA（脱氧核糖核酸）和RNA（核糖核酸）。DNA通常以反向双螺旋的双链结构存在于生物体中。除此以外，部分含有连续重复鸟嘌呤碱基的核酸片段可以通过氢键连接形成G四链体（G4）结构。这种非规范的二级结构在癌症生物学过程中起着至关重要的作用，目前在核基因组和线粒体基因组中都得到了承认。然而，基于G4的靶向治疗对核和线粒体基因组的影响、以及对线粒体功能的影响及其潜在机制在很大程度上仍尚不清楚。
2024年5月13日，四川大学血管和肺部疾病分子药理学贾涛课题组联合法国居里研究所和巴黎高师Sophie Bombard教授、Gilles Gasser教授，在国际权威学术期刊《生物医学科学杂志》（Journal of Biomedical Science，IF 11.0）上发表了关于靶向线粒体G4结构调控线粒体功能的最新研究成果。该研究首次证明了金属铂化合物Pt-ttpy（三联吡啶铂）能够诱导线粒体功能损伤，而这一过程并不依赖于ROS（活性氧物种）的生成，而是与核基因组和线粒体基因组中的G4靶向密切相关。Pt-ttpy在体内外实验中均表现出显著的抗癌效果和更高的安全性，这归因于其通过显著破坏线粒体功能而不产生ROS，从而减少了通常与顺铂等铂类化合物治疗相关的氧化应激副作用。该发现为开发不产生ROS且靶向线粒体的药物提供了重要的见解，并有望开发出既有效抗癌又具有更高安全性的G4结合铂类化合物。
G4结构是以富含鸟嘌呤的重复DNA或RNA序列折叠而成的非规范的独特的二级四链核酸结构。它们通过Hoogsteen氢键连接在一起堆积形成鸟嘌呤四聚体，这些四聚体通过π-π相互作用和一价阳离子稳定。G4ChIP-seq分析发现，人类染色质中约含有10,000个G4结构。G4 Hunter算法的预测显示，线粒体的完整基因组(16.6kb)约有96个G4结构。Pt-ttpy在体外优先通过与外部 G-四分体堆积来稳定 G4 以使双链体 DNA 稳定，还能够通过与环碱基直接配位来有效共价捕获 G4。研究发现，Pt-ttpy可以在癌细胞中尤其是线粒体积聚，并以时间和剂量依赖的方式与卵巢癌细胞A2780的mtDNA(线粒体DNA）结合，影响线粒体基因组功能，使mt DNA拷贝数减少、mt DNA缺失、mt DNA损伤(图1b和c)、抑制mt RNA转录(图1d)和降低mt OXPHOS氧化磷酸化复合体(图1e)的蛋白水平。通过进行FACS、免疫荧光染色和Seahorse系统监测等实验，验证出Pt-ttpy可以使线粒体形态发生改变，诱导了细胞氧气消耗率、ATP合成量等线粒体功能的显著变化。
图1: Pt-ttpy影响线粒体基因组功能
图2: Pt-ttpy对线粒体形态的影响
传统金属铂类药物——顺铂（CisPt)最重要的抗肿瘤机制是通过诱导ROS的大量产生，氧化破坏DNA结构，形成交联阻碍后续的复制和转录，抑制癌细胞的生长和扩散，从而发挥其抗癌作用。但顺铂对于正常细胞的毒性也依赖于ROS的产生，造成了对各器官广泛的毒副作用，使得临床使用受限。因此，课题组自主开发了单细胞同时检测ROS和线粒体ROS的高通量检查方法（图3），筛选了肿瘤细胞、血管内皮细胞、间质细胞已经多个正常细胞，发现与顺铂不同，Pt-ttpy作为一种新型金属铂类化合物，抗肿瘤作用并不依赖于ROS的产生，可能避免了由此带来的类似于顺铂的毒副作用。
图3: 四种肿瘤细胞系和两种原代细胞在Pt-ttpy和CisPt处理后ROS和mt-ROS产生量
Pt-ttpy不仅可以直接作用于线粒体基因，还能通过间接作用于核编码的mt相关基因来诱导mt功能障碍。RNA-seq测序发现，Pt-ttpy特异性下调了14个核编码的mt OXPHOS基因。非常有趣的是，特异性下调的这106个基因中最大的亚队列(包括45个基因)主要涉及线粒体中央法则，特别是影响大多数核编码的mt核糖体基因(30个基因)的表达(图4C、4d和4e)。这些核糖体基因都在其启动子区域显示出较高的G4丰度。后续通过RT-QPCR、CUT&RUN以及免疫荧光化学点击反应等实验均证实，Pt-ttpy可以抑制TAF1和NELFB等转录启动因子在核编码的线粒体核糖体等高G4丰度基因中的募集，影响其转录和新生蛋白的表达，从而导致线粒体功能的障碍，达到抑制肿瘤的作用。
图4: RNA-seq测序：Pt-ttpy特异性下调核基因组中线粒体核糖体相关高G4丰度基因
图5: Pt-ttpy通过降低TAF1及NELFB转录启动因子抑制核基因组中线粒体核糖体相关高G4丰度基因的转录和表达
该研究从体内外水平，发现了Pt-ttpy可以通过作用于核基因组相关基因和线粒体基因，影响其复制、转录和表达，破坏线粒体功能，在不诱导ROS产生下抑制肿瘤细胞增殖和扩散，从而实现抗肿瘤。首次在基因组DNA水平上揭示了人类线粒体核糖体蛋白(MRPs)基因是G4配体Pt-ttpy的靶标。为后续开发G4结合的铂类化合物，在有效抗癌同时提高安全性提供了非常重要的研究基础。
图6: Pt-ttpy特异性作用机制图
本研究的共同第一作者是四川大学硕士研究生匡克丽和李春燕。共同通讯作者是四川大学靶向药物与释药系统教育部重点实验室药理学课题组PI贾涛特聘副研究员和法国居里研究所Sophie Bombard教授。本课题得到了居里研究所博士后项目、教育部重点实验室、四川省科技厅和欧盟ERC等项目的资助。
论文链接：https://rdcu.be/dHQ4s